C5 ′ -Alkyl effets de substitution sur Digitoxigenin α -l-glycoside Cancer Cytotoxicité

C5 ′ -Alkyl effets de substitution sur Digitoxigenin α -l-glycoside Cancer Cytotoxicité

Pendant des siècles, les glucosides cardiaques ont été utilisés pour le traitement de l’insuffisance cardiaque congestive. Le mécanisme menant à cette activité cardiotonique est le résultat de l’inhibition de la Na + / K + ATPase de la membrane plasmique.1,2 La concentration intracellulaire de Na + accumulée augmente la séquestration du Ca 2+ par le réticulum sarcoplasmique et augmente la contractilité cellulaire myocardique par l’excitation et le couplage de contraction. 3; Figure 1), un glycoside cardiaque couramment utilisé à l’origine isolé de Digitalis purpurea, a été reconnu pour son activité inotrope positive, et plus récemment pour son application potentielle en oncologie.4,5 Figure 1Digitoxine (3) La cause de la cytotoxicité des cellules cancéreuses à la digitoxine a inévitablement été associée à l’inhibition de la Na + / K + ATPase et au changement résultant de la concentration en ions Ca2 +. Cependant, de nombreux groupes de recherche ont découvert que la digitoxine induit la mort cellulaire apoptotique à une concentration subcardiotoxique dans le plasma.6 − 10 Ces résultats suggèrent le rôle possible de la liaison de la digitoxine à d’autres cibles biologiques comme un événement inducteur apoptotique. En fait, les effets anticancéreux de l’inhibition de la Na + / K + ATPase sont encore absents. La digitoxinine (pharmacophore) et la fraction trisaccharidique sont connues pour jouer un rôle crucial dans la cardiotoxicité et l’activité anticancéreuse.11 Parce que la digitoxine &#x02019 L’activité cardiotonique est connue depuis beaucoup plus longtemps, la plupart des études sur la relation structure-activité (SAR) se sont concentrées sur l’inhibition de la Na + / K + ATPase et ont examiné l’effet de la modification de la portion glucidique des glycosides cardiaques.12 − récemment, Karlish a démontré que l’inhibition de l’isoforme α 2 sur l’isoforme α 1-Na + / K + ATPase pouvait induire une contraction cardiaque avec une surcharge minimale en Ca2 + et moins de cardiotoxicité16,17. # x003b1; glycoside cardiaque 2-sélectif pourrait résulter de la modification de sucre, comme les différences structurelles dans ces isoformes se trouvent principalement dans les boucles de liaison de glucides extracellulaires. Ainsi, la modification du sucre pourrait offrir la possibilité de découvrir des analogues de la digitoxine nouveaux et plus sûrs avec une activité anticancéreuse améliorée. La première étude SAR de la digitoxine a été menée par Thorson en 2005, lors de la sélection d’une banque de monosaccharides de digitoxine. Plusieurs analogues de β -l-sucre ont montré une cytotoxicité améliorée par rapport à la digitoxine.18 Plus récemment, nous avons réussi à effectuer une série d’études SAR systématiques sur la portion glucidique de la digitoxine pour la cytotoxicité apoptotique dans la lignée cellulaire du cancer du poumon humain (NCI-H460). Ces études comprennent une comparaison de la digitoxine, les MeNO-néo et O-glycosides (avec O – meilleurs que les MeNO-néo-glycosides) 8, une étude de la longueur de la chaîne du sucre (avec mono- meilleure que les di- ou trisaccharides), 10 et une étude stéréochimique des monosaccharides à la digitoxine (les plus actifs étant les β-β-β-β-β-β-glycosides, les β-β-β-β-glycosides étant les plus actifs). nous avons conclu que les O-glycosides étaient meilleurs que les MeNO-neoglycosides8 et que les sucres avec β -d-digitoxo-, α -l-amiceto-, et α -l-rhamno-stéréochimie étaient les plus active.9 Quel que soit le lien glycosidique (O- / neo- et / ou α – / &#x003b2 ;-), la stéréochimie du sucre des monosaccharides était plus efficace que celle des di- et trisaccharides10. notant que ces observations étaient stéréospécifiques (c.-à-d., que les β-amylo-glycosides étaient significativement moins actifs que leurs diastéréoisomères) et que, par conséquent, attribuable à non solubilité spécifique et / ou propriétés de transport de la membrane. Afin de sonder davantage la spécificité de la partie sucre des glycosides α -l-digitoxine, nous avons décidé de tester l’importance SAR de la position C5 ′ -alkyle. Ici, nous rapportons notre étude de synthèse et de cytotoxicité réussie de quatre digitoxigénines α -l-rhamno-glycosides (5 − 8) et de trois digitoxigénines α -l-amicéto-glycosides (10 − 12) en utilisant notre approche asymétrique de novo à l’assemblage de glycoside (figure 11) .Scheme 1Retrosynthetic Analysis of Digitoxin AnaloguesOutlined dans le schéma 1 est notre analyse rétrosynthétique pour la préparation de divers analogues de la digitoxine substitués par C5 ′ -alkyle Nous avons envisagé que les fonctions et fonctionnements rhamno- et amicéto-stéréochimiques souhaités pourraient être mis en place par une réduction de cétone diastéréosélective et une dihydroxylation, ou bien une réduction de diimide, des précurseurs de digitoxine pyranone 17a et 1222. Ces pyranones structurellement diverses pourraient, à leur tour, être préparées. par une glycosylation stéréospécifique catalysée par le palladium pour coupler la digitoxigénine (DigOH) avec les pyranones α -l-Boc 16a − e correspondantes. ous pourrait être simplement modifié par l’utilisation de notre synthèse de carbohydrate asymétrique de novo à partir d’un matériau de départ furannique achiral avec différents acides alkylcarboxyliques substitués par &#x003b1. Approche 2De Novo à & lt; x003b1; -l-Boc-pyranone 16aAs nous Nous l’avons décrit précédemment, la synthèse de C6 ′ -deoxy – α -l-Boc-pyranone 16a a été réalisée avec succès par une séquence pratique en trois étapes à partir de l’acétylfurane 14a (Schéma 2) .19 La stéréochimie absolue du sucre L’alcool furfural résultant 15a (> 99% ee) a été converti en la pyranone correspondante via un réarrangement oxydatif Achmatowicz et une protection Boc stéréodivergente pour obtenir un rapport 4: 1 facilement séparable. de α – / β -mélanges de Boc-pyranones avec un bon rendement global (60 − 70%) 21Scheme 3De Novo Approche des Building Blocks Pyranone 16b − eLa souplesse de ce Achmatowicz de novo approche nous a permis de poursuivre ex étendre la diversité des blocs de construction de sucre Boc-pyranone substitués par un groupe alkyle en C5 et (xb), (16b − e, Schéma 3). Les acétyl-furanes (14b − e) requis avec diverses substitutions α -alkyle (c.-à-d., Éthyle, n-propyle, isopropyle et isobutyle) pourraient être préparés selon une procédure en une seule étape, en deux étapes22. Ainsi, l’addition de furane (13) à une solution d’hexane de n-BuLi a généré une solution de 2-lithiofurane, à laquelle on a ajouté une solution de THF de l’acide carboxylique substitué approprié (< 0,5 équiv) à fournir 14b − e avec de bons rendements. L'exposition des acylfuranes à nos conditions préférées de transfert de phase de réduction asymétrique Noyori (Noyori (S, S), HCO2Na (aq), 10% en mole de CTAB) a donné de bons rendements en alcools furaniques 15b et une excellente pureté énantiomérique (> 98% ee). Les alcools furaniques 15b ont ensuite été oxydés dans les conditions d’Achmatowicz (NBS / H2O), et les intermédiaires de pyranone résultants ont été protégés avec Boc20 pour donner les Boc-pyranones désirés 16b − x003b1; -selectivity.Scheme 4 Approche systémique des analogues α -l-Digitoxin C5 ′ -Alkyl (4 − 12) Avec le C5 ′ -alkyle substitué α -l-Boc- Nous avons ensuite utilisé les blocs de construction de sucre pyranone 16a − ensuite, nous les avons utilisés dans une glycosylation catalysée par le palladium avec de la digitoxigénine (DigOH) pour fournir des pyranones 17a − e (82 − ) en tant que diastéréomère unique avec stéréocontrôle complet au centre anomère (Schéma 4).Le groupe hydroxy-C4 désiré a été installé de manière stéréosélective par réduction de Luche pour donner des alcools allyliques équatoriaux 18a et 772 (99%). C2 ′ − C3 ′ des doubles liaisons en 18a et 10 ont été facilement dihydroxylées dans des conditions Upjohn pour fournir des analogues de la rhamnosyl-digitoxine substitués en C5 et C5 (condition A) .25 En variante, les doubles liaisons ont été réduites pour donner C5 ′ Nous avons décidé d’évaluer d’abord leur cytotoxicité apoptotique par rapport aux cellules cancéreuses humaines du cancer du poumon NCI-H460, avec des aminoglycosides de rhamno- et amicéto-glycosides désirés. α -l-rhamnose (4) et α -l-amicetose (9) servant de témoins. En utilisant nos conditions standard, les neuf composés ont été testés à une concentration unique (50 nM, 12 h), le degré et le mécanisme de mort cellulaire (apoptose ou nécrose) quantifiés en utilisant la méthode de coloration nucléaire Hoechst 33342 / iodure de propidium (Figure Les cellules bleues colorées par Hoechst avec des noyaux condensés et fragmentés indiquent une apoptose, tandis que les cellules complètement rompues (indicatrices de nécrose) ont été colorées en rouge avec de l’iodure de propidium (Figure 2C / D). Bien que tous les analogues de la digitoxine 4 et 12 aient présenté des degrés de cytotoxicité variables, les analogues de C5 et MM4 rhamno-4 et amicéto-9 étaient les plus cytotoxiques (Figure 2A2A). et B) Quelle que soit la puissance, l’apoptose était le mécanisme prédominant de la mort cellulaire pour tous les analogues.Intéressant, la tendance de l’activité de l’apoptose a diminué de façon significative lorsque la taille du substituant C5 ′ -alkyle a augmenté. de C5 ′ masse. (A et B) La mort des cellules apoptotiques (%) a été comparée pour chaque digitoxine rhamnoside et amicétoside substitué par un groupe alkyle en C5 et à une concentration de 50 nM (ANOVA unidirectionnelle; N = 6; ***, P < ). ... La cytotoxicité (apoptose et nécrose) a été évaluée en outre dans un traitement de 12 h de concentration croissante (10 nM à 10 μ M) de médicaments. Ces résultats ont été tracés sur la figure 3, qui montre que tous les analogues induisent une mort cellulaire apoptotique d'une manière dépendante de la dose. Le degré de cytotoxicité résultant de α -l-rhamno-C5 ′ -Me (4) et α -l-amiceto-C5 ′ -Me (9) concorde avec les données de la littérature de la Les valeurs IC50 ont été déterminées par une analyse de régression non linéaire et enregistrées dans le tableau 1. Comme dans les expériences à dose unique, les valeurs de CI50 ont augmenté proportionnellement avec la taille du sous-composant C5 ′ Cette tendance peut être observée à la fois dans les rhamnosides (4 − 8, figure ​ figure 3A) 3A) et dans les amicétosides (9 − 12, figure ​ figure 3B) .3B). Bien que manifestement différente, la puissance de l'analogue C5 ′ -Et-rhamno (5; IC50 57 nM) était seulement légèrement plus faible que celle de l'analogue C5 ′ -Me-rhamno (4; IC50 52 nM) . La sensibilité à cet effet stérique négatif a fortement augmenté au fur et à mesure que des groupes méthylène subséquents ont été ajoutés (par exemple, C5 &numsp = &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp &numsp   et C5 ′ -i-Bu (8; CI50 180 nM)). Il est intéressant de noter que cet effet de la substitution C5 ′ -alkyle semble être encore plus significatif sur la série amiceto (9 − 12), où il y avait une augmentation plus significative des valeurs IC50 avec l'addition de groupes méthylène ( cf., C5 ′ -Me (9; CI50 52 nM), C5 ′ -Et (10; IC50 87 nM), C5 ′ -i-Pr (11; IC50 533 nM), et C5 ′ -i-Bu (12; IC50 458 nM)). Il est à noter que α -l-amiceto-C5 ′ -Me (9) a montré une puissance toujours plus forte dans l'inhibition de la croissance contre le NCI-panel de 60 lignées cellulaires cancéreuses humaines que l'amiceto-C5 ′ - i-Pr (11) et C5 ′ -i-Bu (12) (voir Information complémentaire). Figure 3Cytotoxicité en fonction de la concentration du médicament dans la comparaison de la substitution C5 ′ -alkyle. Courbe de réponse à la dose de mort cellulaire totale (apoptose / nécrose) médiée par des analogues de la digitoxine dans un traitement de 12 h à des concentrations croissantes (10 nM ... Tableau 1 Évaluation de la toxicité des analogues de la digitoxine sur les cellules épithéliales du cancer du poumon humain NCI-H460Pour démontrer que Nous avons décidé de mesurer la cytotoxicité de ces analogues de la digitoxine avec un test différent Nous avons choisi d'utiliser le test MTT pour cette comparaison, qui a évalué la viabilité cellulaire basée sur la mesure de l'activité enzymatique mitochondriale après 48 h. 28,27 Ces résultats (tableau 1 et figure ​ figure 4) 4) ont montré une activité cytotoxique dose-dépendante pour chaque analogue qui était similaire à celle du test d'apoptose.Comme on l'a vu plus haut, une diminution proportionnelle de la cytotoxicité a été observée avec la taille croissante du substituant C5 & spplus. Cette tendance était consistante à la fois pour la rhamnoside (figure ​ (figure 4A) 4A) et l'amicétoside (figure ​ (figure 4B) 4B) pour les analogues de la digitoxine. Il convient de noter, cependant, que la plus grande sensibilité stérique de l'amiceto-série dans le test de l'apoptose n'a pas été observée dans le test MTT.Figure 4 Viabilité des cellules en fonction de la concentration du médicament dans la comparaison de C5 ′ La courbe dose-réponse de la viabilité cellulaire dans un traitement de 48 h à des concentrations croissantes (1 nM à 10 μ M). En résumé, nous avons démontré les effets SAR de la substitution C5 ′ -amicétoside (9). Nos résultats suggèrent que les deux rhamno- et amicéto-analogues occupent un site de liaison similaire et l'orientation dans sa cible avec une petite poche hydrophobe pour le C5 ′ -Me. Bien que ces tendances de cytotoxicité ne soient pas incompatibles avec les modèles d'inhibition de la Na + / K + ATPase, une étude plus poussée est nécessaire. L'efficacité de cette étude SAR systématique a été rendue possible par la flexibilité de cette approche unique de novo de la synthèse des hydrates de carbone. Des efforts supplémentaires visant à optimiser la cytotoxicité et l'élucidation du mécanisme sont en cours et seront rapportés en temps voulu.

Sylvie

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