Découverte de PF-04457845: inhibiteur sélectif de l’urée FAAH hautement efficace, disponible par voie orale et sélective

Découverte de PF-04457845: inhibiteur sélectif de l’urée FAAH hautement efficace, disponible par voie orale et sélective

L’amide hydrolase des acides gras (FAAH) est une enzyme membranaire intégrale qui dégrade la famille des amides d’acides gras. lipides de signalisation, y compris l’endocannabinoïde anandamide.1 − 3 FAAH est une sérine hydrolase qui utilise une sérine catalytique inhabituelle de sérine et de sérine pour hydrolyser efficacement les deux amides et esters.4 L’inactivation génétique ou pharmacologique de FAAH conduit à des niveaux endogènes élevés d’amides d’acides gras6 et une gamme d’effets analgésiques dans divers modèles animaux d’inflammation et de douleur chronique.7 − 9 Fait important, ces phénotypes comportementaux surviennent en l’absence de f les effets secondaires indésirables observés avec les agonistes directs des récepteurs cannabinoïdes, indiquant que FAAH peut représenter une cible thérapeutique attrayante pour le traitement de la douleur inflammatoire et des affections apparentées. Plusieurs classes d’inhibiteurs covalents FAAH réversibles et irréversibles ont été rapportées (Figure ​ Figure11) .27,26 Les inhibiteurs de cétone électrophiles tels que OL-135 (1) forment de manière réversible un hémicétal stabilisé enzymatique entre le site actif Ser241 et le carbonyle électrophile.28 − 29 Les carbamates tels que URB597 (2) inhibent de manière irréversible FAAH par la carbamylation de Ser241 avec le groupe alcoolique servant de groupe partant.31 − 32 Nous et d’autres avons déjà rapporté une série d’inhibiteurs de la FAAH pipéridine / pipérazine urée (par exemple, 3 − 7).Des études mécanistes ont révélé que le PF-750 (4) inhibait la FAAH de façon dépendante du temps en modifiant de manière covalente le nucléophile du site actif de l’enzyme, malgré la stabilité inhérente du groupe fonctionnel de l’urée.33 PF-750 a été confirmé covalente attachée au Ser241 de FAAH par une liaison carbamate par une structure cristalline de rat humanisé (h / r) FAAH dans le complexe avec PF-750.37 Les efforts de chimie médicinale supplémentaires ont mené à l’identification d’une série plus puissante d’inhibiteurs de FAAH basés Le prototype de cette série, PF-3845 (7), inhibe la FAAH en modifiant de manière covalente le site nucléophile de la sérine du site actif de l’enzyme comme prévu et est sélectif pour le FAAH. FAAH par rapport à d’autres sérine hydrolases de mammifères, comme démontré par le profilage protéique basé sur l’activité (ABPP) .22 En outre, plusieurs groupes ont récemment rapporté des inhibiteurs FAAH non covalents apparents sans aucun groupe apparent de sérine-interacting ( c’est-à-dire 8) .40 Figure 1 Profil de sélectivité de PF-04457845 (23) et URB597 (2) par ABPP compétitif. Images de gel de protéomes marqués avec de la FP-rhodamine en présence ou en l’absence d’inhibiteurs de FAAH (piste 1, DMSO, piste 2, 2 à 100 ° C, ligne 3, 2 à 10 ° C, voie M). Nous avons pensé que dans le cas d’une cible comme FAAH, où l’inhibition conduit à des niveaux élevés de substrats endogènes de N-acyléthanolamine (NAE) jusqu’à 20 fois dans les tissus centraux, un inhibiteur irréversible peut être bénéfique car le mécanisme de liaison hors équilibre limite la compétition avec des concentrations élevées de substrat endogène conduisant à une efficacité biochimique accrue.43 En outre, l’effet pharmacodynamique résultant de l’inhibition covalente dépasse souvent la pharmacocinétique de l’inhibiteur, car l’activité enzymatique peut être récupérée uniquement par synthèse d’une nouvelle enzyme ou dans certains cas, par hydrolyse lente de l’adduit d’enzyme covalent Pour minimiser le risque associé au développement d’un inhibiteur covalent, deux principes de conception / criblage critiques ont été soulignés — sélectivité à éviter Dans ce manuscrit, nous décrivons l’évolution d’une série d’inhibiteurs de la benzylidine pipéridine urée FAAH avec une puissance améliorée et des propriétés pharmaceutiques, aboutissant au candidat clinique PF-04457845 (23). Étant donné la nature lipophile des substrats d’amides d’acides gras de FAAH (c.-à-d., P d’anandamide = 6.2), il n’est pas surprenant que l’ajout de lipophilie aux inhibiteurs FAAH dans la région de liaison acyle améliore la puissance.100,48 puissance avec des propriétés physicochimiques appropriées pour identifier les inhibiteurs FAAH avec une biodisponibilité orale élevée qui sont appropriés pour le développement clinique. Pendant l’évolution de 23 à 7, nous nous sommes concentrés sur l’amélioration de la puissance sans compromettre les propriétés druglike essentielles.51 Une stratégie consistait à rigidifier la conformation de la molécule dans le domaine de liaison de la chaîne acyle pour réduire la pénalité entropique de liaison en ayant moins de liaisons rotatives et Un autre domaine clé de l’étude était axé sur la recherche de positions optimales dans la molécule afin d’incorporer la polarité pour moduler les paramètres tels que P et pKa, tout en optimisant les interactions lipophiles dans la poche de liaison de la chaîne acyle. initialement cherché à explorer isostères de pipéridine avec différentes tailles de cycle et des contraintes conformationnelles dans le but de projeter de manière optimale le fragment biaryl éther dans le canal de liaison de la chaîne acyle. Parce que ces urées inhibent FAAH de façon irréversible, la puissance a été mesurée comme kinact / Ki constante de second ordre en utilisant un dosage FAAH humain (hFAAH) couplé à une enzyme et FAAH (rFAAH) comme décrit précédemment.23,37. Les valeurs de Ki sont indépendantes des temps de préincubation et des concentrations de substrat et sont considérées comme la meilleure mesure de la puissance des inhibiteurs irréversibles. Nous avons trouvé que l’incorporation d’une méthylènepipéridine dans la série précédente de quinoléine (c.-à-d. 4) 33 et benzothiophène (c.-à-d. 5) 34 pour donner les analogues 9 et 10 a amélioré la puissance FAAH, en particulier contre l’enzyme du rat. Par conséquent, nous avons fabriqué l’analogue de méthylènepipéridine correspondant dans la série de biaryléther pipéridine PF-3845 (tableau 1). Nous avons été heureux de voir que la méthylènepipéridine 11 était approximativement 2 et 4 fois plus puissante que la méthylpipéridine correspondante 7 pour la hFAAH et la rFAAH, respectivement. De plus, 11 était équipotent contre les enzymes hFAAH et rFAAH. Nous avons également préparé les analogues correspondants de la pyrrolidine (12 𝵤 14) et de l’azétidine (15), mais ceux-ci étaient considérablement moins actifs. Nous ne connaissons pas la raison précise pour laquelle l’activité diminue avec des tailles d’anneau plus petites, mais nous spéculons que l’urée ne peut pas être activée dans la même mesure lors de la liaison dans le site actif FAAH.En outre, nous avons préparé les analogues (E) – et (Z) -3-méthylènepipéridine (16 et 17). L’isomère (E) 16 était environ 19 fois moins puissant que 11 pour la hFAAH, tandis que l’activité était presque complètement abolie dans le cas de l’isomère (Z) 17. Sur la base de ces données, la 4-méthylènepipéridine spacer est optimal dans cet échafaudage de biarylether urea.Table 1Human et Rat FAAH Potency (kinact / Ki valeurs) pour Piperidine Spacer AnaloguesaWe a ensuite examiné la structure − relation d’activité (SAR) de la partie 3-aminopyridyle de la molécule, ce qui constitue la sortie groupe sur la carbamylation de la serine du site actif FAAH levitraenligne.net. Nos travaux antérieurs sur les inhibiteurs de la benzothiophène-urée FAAH ont indiqué qu’un groupe hétéroaryle était préféré à cette position34. Nous étions particulièrement intéressés par l’introduction de substituants à côté de l’azote pyridique et par l’exploration d’autres substitutions hétérocycliques, en raison du potentiel métabolique associé au cytochrome P450. pyridines non substituées. En effet, le composé 11 présentait une inhibition modérée du CYP2D6 et du CYP3A4 (Tableau 2). Comme observé avec les précédents inhibiteurs de l’urée FAAH, l’analogue de la 3-aminopyridine (11) était supérieur aux analogues de la 2-aminopyridine (18) et de l’aniline (19). L’introduction d’un substituant méthyle (20) ou méthoxy (21) à la position 6 de la 3-aminopyridine fournit des analogues avec une puissance légèrement réduite. L’analogue de méthylpyridine (20) avait moins d’inhibition du CYP3A4, mais l’inhibition de CYP2D6 n’était pas affectée. Nous avons ensuite exploré des hétérocycles similaires avec une basicité réduite tout en maintenant la position de l’azote par rapport à la 3-aminopyridine. Comme prévu, le remplacement de la pyridine par la pyrazine (22) ou la pyridazine (23), moins basique, a éliminé toute responsabilité potentielle du CYP. De manière inattendue, les composés 22 et 23 présentaient une valeur de kinact / Ki 2 fois plus élevée pour hFAAH comparé à 11. Nous avons également évalué plusieurs hétérocycles à 5 et 5,6 éléments (par exemple 24 et 25). Ces composés présentaient généralement une puissance réduite pour la hFAAH, mais une puissance accrue pour la rFAAH. Par exemple, le diméthylisoxazole 24 était 5 fois moins efficace pour la hFAAH mais 2 fois plus puissant pour la rFAAH que 23 fois. Cela souligne l’importance du criblage des composés contre les enzymes hFAAH et rFAAH.22 − 34,37 Ainsi, l’échafaudage benzylidènepiperidine pyridazine urée semble être optimal.Tableau 2Human et Rat FAAH Puissance (valeurs kinact / Ki) et CYP IC50 Valeurs pour Heteroaryl Urea AnaloguesaTable 3Human et Rat FAAH Puissance (kinact / Ki Values) des Analogues Biaryl Ether nous avons ensuite examiné la l’importance de l’azote pyridyle ainsi que la position et la nature du substituant sur le fragment biaryléther du côté gauche (tableau 3). L’élimination de l’azote pyridine (c’est-à-dire le composé 26) a entraîné une réduction de 2 fois de la puissance de la hFAAH. Une perte supplémentaire de 10 fois de la puissance résultait de l’élimination du substituant trifluorométhyle comme observé pour le composé 27. Le groupe trifluorométhyle en position 5 du cycle 2-pyridyle fait des contacts clés de van der Waals dans la poche de liaison de la chaîne acyle qui sont En revanche, les substituants en position 6 (34), en position 4 (32) ou en position 3 (33) nuisent à la puissance, ce qui démontre cette masse stérique n’est pas acceptée dans cette région. La position de l’azote dans l’anneau de pyridine est également importante. Fait intéressant, la puissance de 28 pour hFAAH était dans les deux fois de 23, mais la puissance pour rFAAH a été considérablement réduite. Enfin, plusieurs autres substituants se sont révélés tolérés en position 5 (c’est-à-dire 29 − 31), et le groupe trifluorométhyle s’est révélé optimal. Ces efforts en chimie médicinale ont abouti à la découverte de PF-04457845 (composé 23, Tableau 2), une benzylidènepipéridine pyridazine urée qui présentait une valeur kinact / Ki de 3 et 8 fois plus élevée pour hFAAH et rFAAH, respectivement, comparativement à PF-3845 (7). Nous avons également mesuré la puissance FAAH pour 23 en déterminant les valeurs IC50 avec un temps de préincubation de 60 min, et la CI50 était de 7,2 ± 0,63 nM pour hFAAH et 7,4 ± 0,62 nM pour rFAAH (voir les informations de support). Les principales caractéristiques de 23 qui contribuent à son activité comprennent le substituant p-trifluorométhyle et l’azote pyridyle sur le fragment biaryléther, la benzylidènepipéridine urée et le groupe partant 3-aminopyridazine. Il est intéressant de noter que non seulement les hétérocycles pyridine et pyridazine contribuent à la puissance améliorée, mais qu’ils servent également à abaisser la lipophilie et à améliorer les propriétés physico-chimiques (p. ci-dessus) pour 23.PF-04457845 (23) a été synthétisé en six étapes linéaires avec un rendement global de 40% à partir de matières de départ disponibles dans le commerce (Schéma 1). La synthèse a débuté par une substitution aromatique nucléophile du 3- (hydroxyméthyl) phénol par la 2-chloro-5- (trifluorométhyl) pyridine en présence de K2CO3 pour former le biaryléther 35.Le traitement de l’alcool benzylique 35 avec du chlorure de thionyle a donné le chlorure de benzyle correspondant, qui a été mis à réagir avec le phosphite de triéthyle pour donner le benzylphosphonate 36. Horner − Wadsworth − l’oléfine Emmons de 1-Boc-4-pipéridone avec 36 en présence de Le tert-butylate de potassium, suivi par l’élimination du groupe protecteur Boc en utilisant du HCl dans du dioxane, a donné la benzylidènepipéridine 37 sous forme de chlorhydrate. Enfin, la réaction de 37 avec le phénylpyridazin-3-ylcarbamate en présence de diisopropyléthyl amine a fourni l’urée 23.Scheme 1Synthesis of PF-04457845 (23) Nous avons ensuite évalué la sélectivité de PF-04457845 (23) contre la superfamille de la sérine hydrolase de des enzymes (> 200 membres chez l’homme) dont FAAH est membre.33 − 34 Le composé 23 a été profilé à 10 et 100 μ M en utilisant un écran protéomique fonctionnel basé sur le profil protéique basé sur l’activité compétitive ( ABPP) 55 dans la membrane du cerveau et les protéomes hépatiques solubles dérivés de l’homme et de la souris. Nous avons utilisé une sonde ABPP fluorophosphonate (FP) marquée rhodamine, qui sert d’outil de profilage basé sur l’activité générale pour la superfamille sérine hydrolase.58 Les hydrolases à sérine qui montrent des réductions significatives de l’intensité de marquage de la sonde FP en présence d’inhibiteur sont notées comme cibles du composé. La sélectivité de 23 a été comparée à celle de l’inhibiteur de carbamate FAAH URB597 (2) (figure ​ (figure1) .1). Les deux 23 et 2 inhibaient complètement la FAAH dans les protéomes de la membrane de l’homme et de la souris à la fois à 10 et 100 μ M sans cibles off. Cependant, dans les protéomes solubles du foie, le profil de 23 était radicalement différent de celui de 2. Le composé 23 était complètement sélectif car aucune des autres sérine hydrolases FP-réactives n’était inhibée même à 100 ° C. En revanche, 2 ont affiché des cibles multiples, bloquant le marquage FP de plusieurs sérine hydrolases supplémentaires, en particulier parmi les protéines marquées par FP migrant entre 55 et 65 kDa. Plusieurs cibles off ont été complètement inhibées même à 10 μ M 2. Ainsi, 23 est extrêmement sélectif pour FAAH par rapport aux autres sérine hydrolases de mammifères. En outre, 23 présentaient un profil de sélectivité favorable lorsqu’ils étaient comparés à un panel CEREP cible 68 (Tableau S1 dans les Informations de Support) .PF-04457845 (23) a un excellent profil pharmacocinétique chez le rat et le chien ainsi que chez l’homme in vitro. La perméabilité de 23 (AB, 15,2 × 10 Ȣ 6 cm / s et BA, 20,2 × 10 ∢ 6 cm / s) à travers les cellules MDCK était modérée, sans efflux apparent dû à Pgp (le rapport B / A est de 1,33). Le composé 23 a une faible clairance et un volume de distribution modéré chez le rat et le chien (tableau 4). Le composé 23 a été rapidement absorbé après administration orale d’une suspension de méthylcellulose du matériau cristallin avec une biodisponibilité de 88% chez le rat et de 58% chez le chien. Un faible risque d’interactions médicamenteuses est attendu sur la base d’études in vitro d’inhibition du CYP dans des microsomes hépatiques humains en utilisant des substrats appropriés (Tableau S2 dans les Informations complémentaires). Le potentiel de 23 pour former des métabolites réactifs a été étudié, et aucun conjugué de glutathion de 23 n’a été observé à partir d’incubations in vitro d’hépatocytes de rats ou d’humains. On a déterminé que la demi-vie de 23 dans des expériences sur les microsomes hépatiques humains était de 105 min testée à une concentration de protéine de 0,8 mg / mL. La liaison aux protéines microsomales de 23 était de 90%. La clairance sanguine humaine basée sur ces expériences in vitro était estimée à 0,6 ml / min / kg. Sur la base de ces données, 23 devraient convenir à une administration par voie orale une fois par jour chez l’homme.Tableau 4Plasma Données pharmacocinétiques après administration de PF-04457845 (23) (iva et pob Dose de 1 mg / kg chez le rat et 0,5 mg / kg chez le chien) Nous avons ensuite évalué l’efficacité in vivo de PF-04457845 (23) dans un modèle de douleur inflammatoire chez le rat. L’injection sous-cutanée d’adjuvant complet de Freund (CFA) dans la surface plantaire de la patte arrière a produit une diminution significative du seuil de retrait de la patte mécanique (PWT) après 5 jours après l’injection comme décrit précédemment (Figure 22). 23 ont provoqué une inhibition significative de l’allodynie mécanique mesurée après 4 h avec une dose efficace minimale (MED) de 0,1 mg / kg, qui est 30 fois plus faible que celle de PF-3845 (7) (FUM de 3 mg / kg De plus, à la dose de 0,1 mg / kg (po), 23 ont inhibé la réponse douloureuse à un degré comparable à celui du médicament anti-inflammatoire non stéroïdien, le naproxène, à 10 mg / kg (figure 2) .2). On a signalé qu’un blocage quasi-complet de l’activité de FAAH est nécessaire pour maintenir des taux élevés d’anandamide in vivo.60,22 En accord total avec cette observation, l’efficacité in vivo robuste de 23 était accompagnée d’une inhibition presque complète de l’activité FAAH avec des élévations concomitantes dans l’anandamide et d’autres amides d’acides gras cerveau et plasma (les détails seront décrits ailleurs).Le degré d’inhibition de la réponse douloureuse par 23 était similaire pour toutes les doses efficaces, probablement parce qu’une inhibition quasi complète de la FAAH est nécessaire pour obtenir une efficacité in vivo, qui a été atteinte à toutes les doses à partir de 0,1 mg / kg. ) dans le modèle CFA de la douleur inflammatoire chez le rat. Le composé 23, à raison de 0,1 à 10 mg / kg (po), a produit une réduction de l’allodynie mécanique (hyperalgésie) chez les rats (barres noires). Effet de l’anti-inflammatoire non stéroïdien … En conclusion, PF-04457845 (23) est un puissant inhibiteur de la FAAH qui modifie de façon covalente le sérine nucléophile de FAAH au site actif avec une sélectivité exquise par rapport aux autres membres de la superfamille des sérine hydrolases. Le composé a d’excellentes propriétés pharmacocinétiques et convient pour une administration orale une fois par jour. Il est efficace dans le modèle CFA de la douleur inflammatoire chez le rat. Le composé 23 est actuellement évalué dans le cadre d’essais cliniques chez l’humain ayant le potentiel de traiter la douleur chronique et d’autres troubles du système nerveux.

Sylvie

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