Contamination de l’environnement et excrétion virale chez les patients atteints de MERS lors de l’éclosion de MERS-CoV en Corée du Sud

Contamination de l’environnement et excrétion virale chez les patients atteints de MERS lors de l’éclosion de MERS-CoV en Corée du Sud

Contexte Bien que le coronavirus MERS-CoV du syndrome respiratoire du Moyen-Orient soit caractérisé par un risque de transmission nosocomiale, le mode de transmission détaillé et la période d’excrétion virale des patients infectés sont mal compris. MERS-CoV dans les milieux de soins et pour définir la période d’excrétion virale viable des patients MERS Méthodologie Nous avons étudié la contamination environnementale des patients dans les unités MERS-CoV des hôpitaux. MERS-CoV a été détecté par PCR. De nombreuses surfaces environnementales des chambres de patients MERS, y compris des points fréquemment touchés par des patients ou des professionnels de la santé, ont été contaminées par MERS-CoV ARN viral a été détecté jusqu’à cinq jours après la dernière PCR positive des échantillons respiratoires des patients. détecté dans des échantillons d’ante En outre, le MERS-CoV a été isolé à partir d’objets environnementaux tels que des draps de lit, des rampes, des supports de perfusion intraveineuse et des appareils à rayons X. Pendant la phase clinique tardive du MERS, des virus viables ont pu être isolés Conclusions La plupart des surfaces touchables dans les unités du MERS ont été contaminées par des patients et des agents de santé et le virus viable a pu être éliminé par sécrétion respiratoire par des patients cliniquement complètement rétablis. Ces résultats soulignent la nécessité d’une surface environnementale stricte. pratiques d’hygiène, et période d’isolement suffisante basée sur les résultats de laboratoire plutôt que sur les seuls symptômes cliniques

MERS-CoV, Corée du Sud, mode de transmission, contamination environnementale, excrétion virale prolongée Le syndrome respiratoire du Moyen-Orient coronavirus MERS-CoV a été identifié pour la première fois chez un patient décédé d’une pneumonie sévère en Arabie Saoudite en septembre MERS-CoV est un virus à ARN monocaténaire à sens positif, un nouveau membre du genre Betacoronavirus, lignage C, qui est distinct du syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus du SRAS Il peut provoquer un large éventail de manifestations cliniques chez les humains, des infections asymptomatiques à mortelle Bien que le MERS-CoV ait causé une maladie limitée en dehors de la péninsule Arabique, une enquête épidémiologique a révélé que les voyageurs du Moyen-Orient continuent d’exporter des infections sporadiques vers les pays d’Amérique du Nord , Europe , et Thaïlande Bien que le mode de transmission interhumaine du MERS-CoV ne soit pas complètement compris, le virus a souvent causé des problèmes de santé. De même, à la suite de la première flambée de MERS-CoV en Corée du Sud en mai, la contamination généralisée de l’environnement hospitalier a été suspectée comme cause de la transmission rapide, bien que les preuves directes soient limitées. Les premiers jours après le premier cas, des cas confirmés en laboratoire ont été diagnostiqués et ont constitué la plus grande éclosion d’infection à MERS-CoV en dehors de la péninsule arabique. Récemment, l’Organisation mondiale de la Santé et le Ministère de la Santé de la Corée du Sud ont signalé que la propagation initiale du MERS-CoV a été étendue dans plusieurs clusters hospitaliers en raison du surpeuplement dans les salles d’urgence et les services médicaux, ainsi que de mauvaises mesures de contrôle des infections dans les hôpitaux au début de l’épidémie. La Corée qui a contribué à la propagation, y compris les patients à la recherche d’avis médicaux dans plusieurs établissements de santé Bien que l’on présume que le MERS-CoV est transmis par de grosses gouttelettes, des contacts et des aérosols, l’importance relative de la transmission par aérosol par rapport à la propagation par de grosses gouttelettes ou contact est inconnue. Il est urgent de vérifier si la contamination environnementale par des gouttelettes ou d’autres facteurs jouent un rôle dans la transmission nosocomiale du MERS-CoV. Les rôles des vecteurs passifs et des facteurs environnementaux ne doivent pas être négligés dans les soins de santé. Par conséquent, les objectifs de cette étude étaient d’étudier la contribution potentielle de la contamination environnementale à la propagation du MERS-CoV, ainsi que la durée d’excrétion du virus viable par les patients. À cette fin, nous avons échantillonné les surfaces environnementales dans les salles de laboratoire. patients MRS confirmés, et a mesuré le virus par RT-PCR en chaîne par polymérase avec transcription inverse, ainsi que Par culture De plus, nous avons surveillé le virus viable excrété à partir de patients MERS confirmés en laboratoire en phase clinique tardive

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Patients et chambres

Quatre patients MERS confirmés en laboratoire, hospitalisés dans les hôpitaux Chungbuk National University Hospital, Hallym University Kangnam Sacred Heart Hospital de Juin à Juillet, ont été inclus dans cette étude. Les chambres de ces patients ont été sélectionnées pour l’étude environnementale. Après la sortie des patients du MERS, nous avons continué à recueillir des échantillons environnementaux pendant des heures ou des heures. Les échantillons respiratoires des patients et les échantillons environnementaux ont été testés pour la MERS par transcription inverse et PCR, et par culture de virus Les conditions moyennes de température et d’humidité des chambres étaient de ° C et en% infection urinaire. Trois chambres de l’hôpital universitaire national de Chungbuk avaient des changements d’air par heure et le gradient de pression moyen entre la chambre du patient et l’antichambre L’hôpital du Sacré-Cœur de l’université de Kangnam avait des changements d’air par heure, et le gradient de pression moyenne entre la chambre du patient et l’antichambre était hPa

Collection d’échantillons respiratoires

Des expectorations expectorées ont été recueillies dans une cupule d’échantillon. Les expectorations dans la cupule d’échantillon ont été trempées dans le milieu de transport viral U Pénicilline, μg de streptomycine, μg d’amphotéricine B par ml de solution saline tamponnée au phosphate [ Les échantillons d’expectoration de l’hôpital universitaire national de Chungbuk ont ​​été livrés au BLS immédiatement sans être mélangés avec VTM Si un patient ne pouvait pas expectorer les expectorations, l’aspiration trachéale a été recueillie par le biais de l’hôpital Hull. aspiration nasotrachéale

Échantillonnage de surface environnementale

Dans les chambres des patients, des draps, des lits, des tables de lit, des contrôleurs de lit, des étagères, des boutons de porte, des poignées de porte de salle de bain et des planchers ont été frottis. Les équipements de soins des patients tels que les boutons du moniteur patient, les thermomètres, les supports de perfusion intraveineuse, les radiographies portables et les cassettes de radiographie informatisées ont également été échantillonnés. Les étages des antichambres, les antichambres et les entrées d’air du plafond ont également été échantillonnés. les échantillons ont été immédiatement livrés à la BSL

Transcription inverse-PCR RT-PCR et séquençage

L’ARN viral a été extrait de tous les échantillons cliniques ou environnementaux en utilisant QIAampViral RNA Mini kit QIAGEN, Valencia, Californie Les conditions RT-PCR pour quantifier l’ARN MERS-CoV et les paramètres d’amplification ont été décrits précédemment Les amplicons ont été purifiés à l’aide du kit GeneAll GeneAll, Corée et envoyé à Cosmo GeneTech Séoul, Corée pour séquençage commercial avec un séquenceur d’ADN ABI XL Perkin-Elmer, Foster City, Californie Les séquences d’ADN ont été compilées et éditées en utilisant le logiciel d’analyse de séquence Lasergene DNASTAR, Madison, Wisconsin

Culture cellulaire et isolement de virus

Outre la détection de l’ARN viral à partir des échantillons environnementaux, tous les spécimens recueillis dans cette étude ont également été cultivés pour confirmer la viabilité virale. Les cellules Vero E ATCC, CRL ont été cultivées dans du milieu essentiel minimal Eagle Eagle; Lonza avec% de sérum de veau fœtal FCS Gibco et des antibiotiques Les cellules Huh ont été cultivées dans du milieu DMEM de Eagle modifié par Dulbecco; Lonza contenant% FCS, PAA L-glutamine mM, acides aminés non essentiels PAA et antibiotiques L’infection des cellules Vero E et Huh avec chaque échantillon a été réalisée dans du PBS contenant μg / mL de DEAE-dextran et de% FCS comme décrit précédemment CPE Seules les cultures positives pour le MERS-CoV à la fois par RT-PCR et le séquençage ont été considérées comme positives pour l’isolement du virus Tous les travaux avec le MERS-CoV vivant ont été réalisés dans l’installation BSL de BioSafety Level à l’Université Chungbuk National.

Déclaration d’éthique

Cette étude a été réalisée conformément au protocole d’étude approuvé par l’Institutional Review Board de l’Hôpital universitaire national de Chungbuk concernant la collecte des spécimens et l’autorisation des patients pour l’utilisation de leurs spécimens. La méthode de collecte des échantillons cliniques impliquait un risque minime pour les participants Les identifiants des patients ont été retirés des dossiers avant l’analyse de la recherche. Toutes les expériences ont été menées dans un Installation de BSL à l’Université nationale de Chungbuk autorisée par les Centres coréens de contrôle et de prévention des maladies

RÉSULTATS

Caractéristiques démographiques et cliniques des patients infectés par le MERS-CoV

L’âge médian des quatre patients inscrits était des années et tous les patients étaient des femmes. Leurs maladies sous-jacentes et leurs traitements antiviraux sont résumés dans le tableau Tous les patients avaient une pneumonie Trois patients guérissaient, mais le patient mourait plusieurs jours après l’apparition des symptômes. dans la même salle B le même jour et partagé la chambre pendant des jours en raison de l’absence de chambres d’isolement d’infection de l’air-os dans notre hôpital Cependant, le patient a été déplacé dans une autre pièce C après la mort du patient et y est resté jours avant la sortie du patient Le patient est resté dans la chambre A pendant plusieurs jours et le patient est resté dans la chambre D pendant plusieurs jours.

Tableau Patient Caractéristiques Patient Nombre Sexe Sexe Maladies sous-jacentes Traitement antiviral Résultat F DM, Hypertension peg-IFN ribavirine lopinavir / ritonavir d F F DM récupéré, Infarctus cérébral Néant le jour F DM, Hypertension, Fracture gauche du fémur peg-IFN ribavirine lopinavir / ritonavir d Récupéré F Aucune peg-IFN ribavirine lopinavir / ritonavir d Nombre de patients récupérés Âge Sexe Maladies sous-jacentes Traitement antiviral Résultat F DM, Hypersensibilité peg-IFN ribavirine lopinavir / ritonavir d Récupérée F DM, Infarctus cérébral Aucune Décédée le jour F DM, Hypertension, Fémur gauche fracture peg-IFN ribavirine lopinavir / ritonavir d récupéré F aucun peg-IFN ribavirine lopinavir / ritonavir d récupéré Abréviations: DM, diabète sucré; peg-IFN, interféron pégylé Large

Délivrance virale de la RT-PCR et de la culture des patients

Lorsque nous avons commencé à recueillir les échantillons respiratoires pour la RT-PCR MERS et la culture virale, tous les patients n’avaient aucun symptôme clinique. En résumé, les patients enrôlés ont montré des résultats positifs pour l’isolement du virus pendant cette étude. Parmi les patients, le dernier jour où le MERS-CoV a pu être détecté sur les expectorations des patients était le jour de l’apparition de la maladie. Le dernier jour d’isolement du virus pour les autres cas était sur le patient et le patient. Tableau de début Bien que nous ayons échoué à isoler le virus, nous avons pu détecter l’ARN du MERS-CoV par RT-PCR à partir des échantillons respiratoires du patient le jour suivant l’apparition de la maladie.

Tableau Résultats de la réaction en chaîne de la polymérase et de la culture pour les échantillons respiratoires et environnementaux Statut du patient en salle; Emplacement d’échantillonnage; Méthode de détection du CoV du MERS Jour de prélèvement des échantillons après le début du symptôme du patient d d d d d d d d d d A Patient en état de patient Déchargé Echantillon respiratoire du patient; PCR – – Échantillon respiratoire du patient; culture virale – – Chambre du patient; PCR – – Chambre du patient; culture virale – – Matériel médical; PCR – – Matériel médical; culture virale – – Anteroom / système de ventilation; PCR – Anteroom / système de ventilation; culture virale – – B patient patient et P mort, P transféré dans l’échantillon respiratoire du patient de la salle C; PCR * Spécimen respiratoire du patient; culture virale * Chambre du patient; PCR – Salle du patient; culture virale – – – – Matériel médical; PCR – – Matériel médical; culture virale – – – Anteroom / système de ventilation; PCR – – – – Anteroom / système de ventilation; culture virale – – – – C Patient en état de patient P transféré dans la pièce C Echantillon respiratoire du patient déchargé; PCR – – Échantillon respiratoire du patient; culture virale – – Chambre du patient; PCR Chambre du patient; culture virale – – – Matériel médical; PCR – – – Matériel médical; culture virale – – – Anteroom / système de ventilation; PCR – – Anteroom / système de ventilation; culture virale – – – – D Statut du patient patient Déchargé Echantillon respiratoire du patient; PCR – Spécimen respiratoire du patient; culture virale – – – Chambre du patient; PCR – – – Chambre du patient; culture virale – – – – – – – Matériel médical; PCR – – – Matériel médical; culture virale – – – – – – – Anteroom / système de ventilation; PCR – – – – – Anteroom / système de ventilation; culture virale – – – – – – – Statut du patient dans la chambre; Emplacement d’échantillonnage; Méthode de détection du CoV du MERS Jour de prélèvement des échantillons après le début du symptôme du patient d d d d d d d d d d A Patient en état de patient Déchargé Echantillon respiratoire du patient; PCR – – Échantillon respiratoire du patient; culture virale – – Chambre du patient; PCR – – Chambre du patient; culture virale – – Matériel médical; PCR – – Matériel médical; culture virale – – Anteroom / système de ventilation; PCR – Anteroom / système de ventilation; culture virale – – B patient patient et P mort, P transféré dans l’échantillon respiratoire du patient de la salle C; PCR * Spécimen respiratoire du patient; culture virale * Chambre du patient; PCR – Salle du patient; culture virale – – – – Matériel médical; PCR – – Matériel médical; culture virale – – – Anteroom / système de ventilation; PCR – – – – Anteroom / système de ventilation; culture virale – – – – C Patient en état de patient P transféré dans la pièce C Echantillon respiratoire du patient déchargé; PCR – – Échantillon respiratoire du patient; culture virale – – Chambre du patient; PCR Chambre du patient; culture virale – – – Matériel médical; PCR – – – Matériel médical; culture virale – – – Anteroom / système de ventilation; PCR – – Anteroom / système de ventilation; culture virale – – – – D Statut du patient patient Déchargé Echantillon respiratoire du patient; PCR – Spécimen respiratoire du patient; culture virale – – – Chambre du patient; PCR – – – Chambre du patient; culture virale – – – – – – – Matériel médical; PCR – – – Matériel médical; culture virale – – – – – – – Anteroom / système de ventilation; PCR – – – – – Anteroom / système de ventilation; la culture virale – – – – – – – La case en pointillés pour chaque chambre indique que le patient était dans la pièce. Abréviations: MERS CoV, Moyen-Orient Respiratory Syndrome coronavirus; P, Patient; P, Patient; P, Patient; P, Patient; PCR, amplification en chaîne par polymérase; RT-PCR, transcription inverse amplification en chaîne par polymérase * Les deux P et P étaient positifs pour la RT-PCR et les isolements de virusL’entrée de l’équipement de ventilation sur le plafond, drap de lit, contrôleur de lit, bedrail, contrôleur de lit, , bouton de porte de salle de bain, bouton de porte, sol d’antichambre, table de lit, barrière de lit, table de chevet, barrière de lit, cassette de radiographie, appareil de radiographie portable, thermomètre, table d’antichambre View Large

Contamination environnementale des chambres du patient

Dans la chambre A, seule l’entrée d’air du plafond a été testée positive pour l’ARN viral après la sortie du patient suite à une récupération complète. Cependant, dans la chambre B, la chambre du patient et son équipement médical ont été testés positifs pour l’ARN viral. L’équipement médical dans la chambre du patient et dans l’antichambre a commencé à être positif à l’ARN viral après l’entrée du patient dans la chambre C Dans la chambre D, la chambre du patient et l’équipement médical étaient positifs pour le virus. à quelques heures après le dernier PCR positif du patient Les résultats de la RT-PCR avec les échantillons environnementaux ont révélé que les contrôleurs de lit des échantillons,%, supports de prélèvement IV des échantillons,%, antichambres des spécimens,% et rampes des échantillons,% Tableau positif Les nombres détaillés d’échantillons positifs provenant de tous les échantillons environnementaux testés sont résumés dans le tableau La durée de la détection de l’ARN viral m échantillons environnementaux depuis la dernière PCR positive du patient a varié de à jours L’échantillonnage environnemental a été continué dans les salles A, B et C pour la même période en raison du calendrier de désinfection pour les nouveaux patients A noter, des ARN viraux ont également été détectés dans les échantillons des étages des antichambres et des antichambres de la chambre C et de la pièce D, zones inaccessibles aux patients par eux-mêmes. Nous avons également testé les échantillons environnementaux des machines à rayons X et des thermomètres utilisés pour les contrôles de routine des patients. Les résultats de la PCR et du séquençage ont révélé que des échantillons d’ARN viraux étaient positifs pour l’ARN viral, ce qui suggère que les instruments médicaux pourraient également être une source de propagation du virus. Des virus infectieux ont également été trouvés dans certains échantillons environnementaux, y compris ceux du lit. feuilles salle C, IV salle de cintre fluide C, salle de bedrail D, salle d’anti-chambre salle D, et des appareils de radiographie salle D Tables et Il est à noter que le virus a été récupéré d à partir de l’échantillon prélevé du dispositif de suspension de perfusion intraveineuse dans la salle C, même le jour où le patient était négatif pour l’ARN viral, tel qu’évalué par RT-PCR Table

Tableau Fréquence de la positivité de l’échantillon environnemental pour le syndrome respiratoire du Moyen-Orient Coronavirus en transcription inverse Transformation en chaîne de la polymérase ou culture virale Résultats de la PCR sur site Positivité Pourcentage, pourcentage de résultats de culture% de positivité, / Bedrails / / Tables de lit / Etagères / / Boutons de porte / / Boutons de porte de salle de bain / / Sol patient / / Boutons patient / / Thermomètres / / Porte-flacons IV / / Radiographie portative / / Cassette de radiographie / / Sols antichambres / / Tables d’antichambre / / Entrées des équipements de ventilation / / Swab Site PCR Résultats Positivity Pourcentage,% Culture Résultats Positivity Pourcentage,% Draps / / Bedrails / / Tables de lit / / Contrôleurs de lit / / Tablettes / / Boutons de porte / / Boutons de porte de salle de bain / / sol / / Boutons de moniteur patient / / Thermomètres / / Fluide IV cintres / / Radiographies portatives / / Cassette de radiographie assistée par ordinateur / / Sols de vestibules / / Tables d’antichambre / / Entrées des appareils de ventilation / / Abréviation: PCR, réaction en chaîne de la polyméraseView Large

DISCUSSION

e détectée dans les sécrétions respiratoires pendant des semaines , nous avons constaté que le virus pouvait être isolé des crachats jusqu’au jour suivant l’apparition de la maladie. Cette découverte suggère que les patients infectés peuvent perdre du MERS-CoV dans les sécrétions respiratoires pendant plus de Cette excrétion virale prolongée peut entraîner une contamination persistante de l’environnement du patient même lorsque les symptômes cliniques et les anomalies biologiques sont résolus. Des stratégies de prévention et de prévention des infections doivent donc être appliquées aux patients MERS isolés, non seulement pendant la Nos résultats suggèrent également que la politique d’isolement et de quarantaine pendant une épidémie de MERS devrait être considérée sur les résultats de laboratoire PCR ou la culture virale plutôt que sur l’amélioration des symptômes des patients. En outre, MERS-CoV était isolé de l’équipement médical dans les chambres des patients même après Dans leur étude, van Doremalen et ses collègues ont rapporté que le MERS-CoV pouvait être récupéré des échantillons après stockage pendant des heures à ° C en% d’humidité relative. De plus, ils ont trouvé que MERS-CoV était plus stable que la grippe A Cette caractéristique du MERS-CoV augmente la probabilité de transmission de contact et de fomite, et par conséquent, lorsque possible, des dispositifs médicaux tels que des thermomètres, des appareils de radiographie ou des supports de perfusion intraveineuse doivent être conservés dans la chambre du patient. Tous les dispositifs médicaux doivent être nettoyés soigneusement avant de quitter la chambre du patient. Des vestibules sont nécessaires pour maintenir le gradient de pression des salles d’isolement et réduire la migration des particules infectieuses de la salle d’isolement dans le couloir. mettre et enlever l’équipement de protection individuelle EPI Habituellement, les dispositifs médicaux utilisés dans les chambres e désinfecté dans les antichambres; Dans notre étude, le MERS-CoV a été détecté sur les sols et les bureaux des antichambres. Ceci suggère qu’à moins que l’antichambre soit fréquemment désinfectée, le virus viable peut être propagé dans le couloir par du personnel médical ou des dispositifs médicaux. quitter les chambres des patientsSur la base des résultats de notre étude, on peut conclure que l’environnement autour des patients MERS est largement contaminé; Afin de protéger les travailleurs de la santé, des lignes directrices plus strictes sur le contrôle des infections sont nécessaires, y compris des méthodes pour prévenir la transmission du MERS-CoV. Les directives actuelles suggèrent que les gants, les blouses, les respirateurs et les protecteurs oculaires serviront à protéger les patients. De plus, étant donné que les EPI peuvent être contaminés par le MERS-CoV pendant le traitement des patients, il est nécessaire de prendre plus de précautions. À cette fin, les miroirs placés dans les antichambres peuvent aider les travailleurs de la santé à vérifier leur état EPI avant d’entrer dans les chambres des patients et lors de l’enlèvement des EPI afin d’éviter les risques d’infection. En outre, il est raisonnable de supposer que la surface des flacons d’échantillon et des gobelets Le MERS doit être désinfecté avant d’être transporté au laboratoire de l’hôpital. La transmission par aérosol d’un agent très virulent pourrait infecter largement le personnel et entraîner une épidémie importante; cependant, avant l’étude actuelle, la transmission du MERS-CoV était limitée aux clusters familiaux et hospitaliers, impliquant une propagation virale par contact étroit et des gouttelettes plutôt que des particules virales en suspension dans l’air Bien que nous ayons échoué à isoler le virus viable par culture cellulaire Tableau, il est à noter que l’ARN viral a été détecté à l’entrée de l’équipement de ventilation, suggérant l’existence potentielle de particules virales aéroportées. Notre étude a inclus un petit nombre de patients en phase clinique tardive pour confirmer la transmission aérienne. Nos données démontrent que la contamination de l’environnement par les patients et les travailleurs de la santé survient fréquemment dans les salles d’isolement des infections MERE et que le virus viable peut être excrété par les expectorations respiratoires. aussi longtemps que quelques jours après l’apparition de la maladie Nettoyage fréquent et minutieux de l’environnement De plus, des directives détaillées et préexistantes devraient être en place pour désinfecter l’environnement, protéger les travailleurs de la santé des surfaces contaminées des hôpitaux et isoler les patients pendant un certain temps. période de temps suffisante pour limiter la propagation du virus

Remarques

Contributions des auteurs S Y B, J Y H, M-S S, J L, H W J et Y C C recherche conçue; S Y B, J Y H, M -S S, J L, E-H K, S-J P, H-i K, S m K, Y-i K, Y-J S, I-W L, W-S C, Y H B, J M, H W J et Y K C ont effectué des expériences; S Y B, J Y H, M-S S, J L, E-H K, S-J P, H-i K, S m K, Y-i K, Y-J S, I-W L, W-S C, H W J et Y K C données analysées; SYB, JYH, MS S, JL, HWJ, et YKC a écrit l’article Soutien financier Ce travail a été en partie soutenu par une subvention du projet de technologie de la Corée Healthcare R & D, ministère de la Santé et du Bien-être, République de Corée Programme de recherche scientifique par la Fondation nationale de recherche de Corée NRF financé par le ministère des Sciences NRF – Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signalé Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels Conflits d’intérêts que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit a été divulgué

Sylvie

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