Expérience pluriannuelle dans le diagnostic des infections virales du système nerveux central avec un panel de tests de réaction en chaîne de la polymérase pour la détection des virus

Expérience pluriannuelle dans le diagnostic des infections virales du système nerveux central avec un panel de tests de réaction en chaîne de la polymérase pour la détection des virus

Contexte La réaction en chaîne de la polymérase La PCR est de plus en plus courante dans les laboratoires de diagnostic Dans certains cas, sa valeur a été établie Dans d’autres cas, des essais existent mais leur utilisation bénéfique n’a pas été déterminée. Les résultats de la PCR ont été analysés en conjonction avec des informations sur l’âge et le sexe du patient, le délai entre le début et le prélèvement des échantillons, et d’autres variables. Les dossiers médicaux ont été examinés pour les patients afin d’obtenir des informations diagnostiques et épidémiologiques sur les cas d’encéphalite non résolus. Résultats Un total d’échantillons PCR positifs ont été détectés Les entérovirus représentaient le plus grand nombre [%] de résultats PCR positifs, suivis du virus herpès simplex [ %], virus varicelle-zona [%] et virus West Nile WNV [%] La réponse à l’encéphalite des Centers for Disease Control et Prevention a été la plus forte diminution du pourcentage de résultats de PCR positifs Globalement, le taux de positivité PCR pour les échantillons prélevés dans les jours suivant le début de la maladie était de%, comparé au% pour les échantillons La valeur de la PCR dans le diagnostic des infections virales a été établie La PCR est moins importante dans la détection du VNO dans le SNC que dans les tests sérologiques, mais elle est plus utile dans la détection d’autres arbovirus, en particulier les virus dans le sérogroupe de Californie Les examens médicaux ont indiqué que l’infection apparente du SNC se résout dans ~% des cas

Au cours de la décennie précédente, la technologie d’amplification des acides nucléiques, en particulier la PCR, a été appliquée et acceptée de plus en plus en laboratoire. Ces méthodes se sont révélées particulièrement utiles dans les situations où l’agent d’intérêt ne peut être récupéré in vitro ou L’un des plus difficiles de ces problèmes a été le diagnostic d’infections virales du SNC. A cet égard, il a été démontré que la PCR est appropriée pour la détection des infections du SNC dues à De même, avec l’ajout d’une étape de transcription inverse pour convertir l’ARN en ADNc, la RT-PCR est au moins aussi sensible que la culture cellulaire pour la détection des infections du SNC associées à l’infection par le virus de l’herpès simplex. avec des entérovirus, et il est plus rapide que la récupération du virus dans la culture cellulaire Les paires d’amorces ont été identifiées et signalées pour l’amplification de la plupart des virus de Intérêt clinique ou expérimental En revanche, il y a eu relativement peu de rapports sur l’application de la PCR à un nombre relativement important de patients suspectés d’infections virales du SNC Depuis plusieurs années, les Virology Laboratories du Wadsworth Center Albany a utilisé une batterie de tests de PCR conçus pour l’application au LCR et au tissu cérébral pour détecter toute une gamme de virus. Les virus qui peuvent être détectés dans la batterie de tests PCR incluent des arbovirus d’intérêt à New York associés à des infections du SNC. Les résultats pour les premiers patients ont déjà été rapportés Cet article résume les résultats obtenus pour les patients présentant une infection apparente du SNC pendant – et pour les patients pour lesquels des examens médicaux ont été effectués. En plus des résultats PCR / RT-PCR, des observations importantes sont apparues concernant les critères cliniques utilisés pour distinguer entre l’encéphalite et la méningite et la proportion de h cas pour lesquels une étiologie n’a jamais été déterminée

Patients, méthodes et matériaux

Patients et données Le groupe d’étude comprenait des patients ayant reçu un diagnostic d’encéphalite ou de méningite d’étiologie inconnue et des échantillons de LCR et / ou de tissu cérébral soumis au Laboratoire de Virologie Clinique du NYSDOH du Département d’Etat de New York; Albany entre juillet et septembre Les professionnels de la santé ou les hôpitaux de l’État de New York ont ​​soumis les échantillons au laboratoire de virologie clinique sans sélection ou limitation, sauf qu’un échantillon d’une quantité suffisante de mL pour le LCR et de tissu pour permettre des tests adéquats. Les données sur les patients ont été obtenues à partir d’un formulaire spécialement conçu qui accompagnait les échantillons soumis. Il incluait les caractéristiques démographiques de base âge, sexe et lieu de résidence et symptômes cliniques, temps de survenue, numération cellulaire du LCR et niveaux de glucose et de protéines. En outre, des données détaillées sur les patients ont été recueillies sur le sous-groupe de patients hospitalisés pendant le test de diagnostic. PCR Laboratory Wadsworth Centre, NYSDOH a développé un panel de PCR et RT-PCR qui ont permis de tester des échantillons de LCR et de tissus cérébraux pour un large éventail de virus associés aux infections du SNC humain. Le panel de PCR initial pourrait détecter l’agent de l’EEE, virus de Californie-sérogroupe, par exemple, LaCrosse [LAC virus de Jamestown Canyon, le virus Cache Valley et le virus de la rage trouvé dans le virus de la salive de Cache Valley ont été inclus en raison d’un cas humain mortel en Caroline du Nord et parce que ce virus est régulièrement récupéré des moustiques à New York. Des tests pour la détection de types HSV et virus varicelle-zona VZV, cytomégalovirus CMV, Epstein-Barr virus EBV, entérovirus, virus St Louis encéphalite SLE, et Powassan virus POW ont été ajoutés au panel In, après le déclenchement du virus West Nile WNV infection à New York, un test de RT-PCR pour le VNO a été ajouté à la batteriePCR et RT-PCR ARN et l’ADN ont été simultanément extraites des échantillons cliniques de CSF ou de tissu avec Trizol LS réactif Invitrog fr, selon les instructions du fabricant. En bref, on a extrait un μL de CSF ou de suspension tissulaire avec du réactif Trizol LS et on a d’abord transcrit l’ARN en ADNc dans un mélange réactionnel μL contenant mmol / L de Tris-HCl pH; mmol / L de KCl; mmol / L de MgCl; mmol / L chacun de dATP, dGTP, dCTP et dTTP; μg d’hexamères aléatoires Roche Diagnostics; et des unités de la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney Invitrogen Le mélange réactionnel a été incubé pendant min à ° C, pour min à ° C, et pour min à ° C et a été refroidi à ° C pendant min après transcription inverse, un aliquot μL d’ADNc a été ajouté à μL de mélange PCR contenant mmol / L de Tris-HCl pH; mmol / L de KCl; mmol / L de MgCl; mmol / L chacun de dATP, dGTP, dCTP et dTTP; μM d’amorces; Les séquences des amorces sont répertoriées dans le tableau Le profil thermique pour la PCR se composait d’un min initial à ° C, suivi de la présence de virus de l’herpès dans le panel. par des cycles répétitifs de s à ° C, de s à ° C pour les virus à ARN ou de ° C pour les virus à ADN, et de s à ° C, suivi d’une extension -min à ° C pour les produits d’amplification cyclique sur% agarose gel EM Science contenant du bromure d’éthidium Pour tout virus pour lequel une bande correspondant à un résultat positif a été observée, la bande a été excisée du gel d’agarose à bas point de fusion et a été séquencée directement sur la tranche de gel sans autre purification. utiliser un séquenceur automatique modèle A; Biosystèmes appliqués

Tableau View largeTélécharger des amorces d’oligonucléotides utilisées dans le panel de PCR – Laboratoire de Virologie Clinique du Département de Santé de l’Etat de New York, Juillet – Septembre Tableau View largeTélécharger les diapositives d’oligonucléotides utilisées dans le panel PCR – New York State State of Health

Résultats

Des échantillons cliniques de LCR ou de tissu ont été examinés simultanément pour un panel de virus par PCR et / ou RT-PCR, comme décrit dans Patients, Methods, and Materials. Un résumé des résultats du test par rapport à l’âge et au virus du patient est présenté dans le tableau. les patients pour lesquels les données sur le sexe étaient disponibles,% étaient des hommes et% étaient des femmes Un total de% des patients étaient positifs pour la PCR pour les virus testés dans le panel Parmi ces patients,% étaient des hommes et% étaient des entérovirus femelles. la plus grande fraction des résultats positifs de la PCR, suivie par HSV, VZV, et WNV. Il y avait des patients, tous immunodéprimés, avec des échantillons de CSF qui ont été testés positifs pour le CMV EBV a également été trouvé dans le CSF des patients. et provenaient d’individus immunodéprimés. Le quatrième était de type EBV, mais les données d’accompagnement étaient insuffisantes pour permettre de tirer une conclusion sur l’état immunologique du patient. les arbovirus du sérogroupe californien; Les derniers cas d’infection par le virus de Jamestown Canyon ont été particulièrement remarquables et ont été signalés ailleurs Sur la base des données de l’historique des voyages, il semble qu’un seul patient testé positif au LED ait été infecté ailleurs et est tombé malade peu de temps après son retour à New York

Tableau View largeTélécharger les patients avec des résultats de PCR positifs dans l’État de New York, par groupe d’âge- juillet – septembre Tableau Agrandir les diapositivesTélécharger les patients avec des résultats de PCR positifs dans l’État de New York, par groupe d’âge- juillet-septembre Les virus les plus fréquemment détectés, entérovirus et HSV, ont été trouvés dans un large spectre d’âge Les nombres pour les autres virus étaient trop petits pour être généralisés, bien que les caractéristiques d’âge associées aux cas de VNO reflètent la tendance bien connue du VNO à produire les infections les plus graves chez les patients. ans Le NYSDOH a également participé à un programme plus vaste parrainé par les Centres de contrôle et de prévention des maladies pour lutter contre l’encéphalite, dans lequel ce syndrome était défini comme incluant les critères suivants: âge de & gt; mois, un état mental altéré persistant pour & gt; h, et ⩾ des symptômes suivants: fièvre, convulsions, anomalies neurologiques focales, anomalies du liquide céphalorachidien et résultats anormaux d’électroencéphalographie ou de neuro-imagerie. Pour identifier les cas à analyser, ces critères ont été appliqués aux cas cliniques accompagnant les échantillons. La première rangée du tableau récapitule les résultats globaux de la PCR en termes de résultats positifs par virus. La deuxième rangée présente des données similaires pour les patients répondant à la définition d’encéphalite ci-dessus. Il n’est pas surprenant que le plus grand nombre de résultats positifs les critères étaient associés aux infections entérovirales, bien que les exclusions ne se limitent pas exclusivement à ce groupe de virus. Les troisième et quatrième rangées du tableau illustrent l’effet sur les résultats de l’étude d’une altération de l’état mental ou de l’âge. mois à partir des critères de sélection L’effet de la première peut être considéré comme particulièrement significatif L’information dans la cinquième rangée démontre que l’utilisation de ces variables seul taux de résultats positifs,% est suffisante pour obtenir essentiellement le même résultat que celui obtenu définition complète a été employé taux de résultats positifs,%

Les résultats de l’essai PCPCR pour les patients atteints d’infections du système nerveux central, selon les critères de sélection, ont été testés dans l’État de New York, juillet – septembre. – Septembre Il a été rapporté que des numérations leucocytaires élevées et / ou des niveaux élevés de protéines sont utiles dans le dépistage des échantillons de LCR pour identifier les situations dans lesquelles les bénéfices de la PCR sont plus susceptibles d’être réalisés. & gt; mg / dL et des comptes de leucocytes élevés comme & gt; Parmi les patients qui ont subi des tests par notre laboratoire, des informations appropriées pour une évaluation similaire étaient disponibles pour le dernier groupe,% répondaient à l’un ou aux deux critères ci-dessus. ou les deux critères Parmi les résultats positifs chez les patients sans valeurs élevées, étaient pour les entérovirus, étaient pour le VNO, et était pour CMVOune des questions les plus importantes en ce qui concerne l’utilisation réussie de tout test pour détecter le virus dans un spécimen particulier est le meilleur moment , au cours de la maladie, pour obtenir l’échantillon avec un échantillon tel que le LCR, il n’est pas possible de faire une évaluation dans le temps, et les données nécessaires ne peuvent être compilées empiriquement. Cette information est présentée dans le tableau pour le PCR -spécimens positifs testés dans notre laboratoire Il est à noter que cette compilation est basée sur le nombre de spécimens et aussi que la date d’apparition des symptômes doit avoir été fournie par le demandeur Par conséquent, pour certains virus, les nombres sont inférieurs au nombre de patients avec des résultats positifs à la PCR, alors que pour d’autres parce que & gt; Le spécimen de LCR a été reçu pour certains patients, les chiffres sont supérieurs au nombre de patients avec des résultats positifs à la PCR. On peut voir que le taux de détection le plus élevé se produit avec des échantillons prélevés dans les premiers jours après le début. % Il diminue par la suite, de sorte que les jours et au-delà, c’est & lt;% Globalement, le taux positif pour les échantillons collectés dans les jours suivant le début de la maladie était% des patients, comparé au% des patients collectés ⩾ jours après le début du risque. ,; % CI, – Lorsque les entérovirus ont été omis de cette évaluation, il y avait beaucoup moins de variation dans la proportion d’échantillons donnant des résultats positifs: environ% -% des spécimens collectés pendant la période incluse dans l’analyse testés positifs pour le virus

Table View largeTélécharger slideIntervalle entre le moment de l’apparition des symptômes et le moment de la collecte des échantillons du système nerveux central – État de New York, juillet – septembre Table View largeTélécharger slideIntervalle entre l’apparition des symptômes et le moment de la collecte des spécimens CNS – État de New York, juillet – septembre Pour obtenir une vue d’ensemble plus complète de l’évolution de la maladie et comment elle a finalement été résolue, des tableaux médicaux ont été demandés pour les patients testés pendant – Pour les tableaux reçus et examinés, la tranche d’âge médiane était de – ans. Le tableau résume les autres conclusions de l’examen des dossiers en ce qui a trait à la résolution finale des cas. Un total de cas% a été résolu par un test de PCR. un diagnostic apparent a été fait pour un patient supplémentaire% Par conséquent, ~% des cas avec une étiologie infectieuse soupçonnée est resté résolu

Table View largeTélécharger la fiche pour les patients testés dans l’État de New York entre et Table ViewDownloadTélécharger la diapositive pour les patients testés dans l’État de New York entre et

Discussion

Des données suffisantes ont été accumulées pour démontrer la valeur de la PCR dans le diagnostic de l’infection virale. Les sujets les plus préoccupants sont les situations et circonstances dans lesquelles la PCR est la mieux déployée. Dans le cas du HSV et des entérovirus, la PCR peut être considérée comme la nouvelle norme. pour le diagnostic, parce qu’il existe suffisamment de données provenant de divers laboratoires justifiant son utilisation pour le diagnostic des infections du SNC dues à ces virus. Bien que les informations disponibles pour d’autres virus soient prometteuses, les bases de comparaison sont souvent limitées et il est plus difficile opinion Par exemple, en ce qui concerne le VNO, il a été rapporté que la sensibilité de la PCR était de ~%, comparée aux cas sérologiquement confirmés dans le foyer de New York en . Notre expérience est en accord avec cette constatation. Le VNO provenant de patients humains par culture cellulaire a donné lieu à des tests de PCR et à une analyse de la séquence des acides nucléiques fournissant presque tous les connaissance des relations entre la variante associée aux infections humaines en Amérique du Nord, la variante circulante chez les animaux et les isolats d’autres parties du monde Ainsi, même avec une sensibilité diminuée à des fins diagnostiques, l’utilisation de la PCR pour diagnostiquer les cas de VNO L’infection est indéniableEn ce qui concerne les autres arbovirus, en particulier ceux du sérogroupe californien, la PCR semble avoir une sensibilité supérieure ou supérieure à celle du WNV NYSDOH, données non publiées. En outre, la PCR a fourni des informations précieuses sur les caractéristiques moléculaires du canyon de Jamestown. variante associée aux infections humaines A notre connaissance, à ce jour, c’est la seule information disponible, car il n’y a pas encore d’isolats humains du virus Jamestown Canyon cerfeuil. Les résultats de l’examen des dossiers impliquent que seulement ~% des infections apparentes du SNC sont résolues. l’information n’est pas facilement accessible au laboratoire au moment de la présentation du ne peut être obtenu que par un suivi Il est intéressant de noter que l’estimation en% de la proportion de toutes les infections du SNC non résolues n’est pas très différente de la valeur récemment publiée de% pour les cas d’encéphalite catégorisés L’importance de cette observation est au moins – d’abord, la résolution finale du cas doit être connue dans toute tentative d’estimation du nombre de cas suspectés d’infection du SNC qui ne sont pas diagnostiqués Deuxièmement, il est pertinent de tenter de comprendre pourquoi la proportion de cas qui étaient PCR- les résultats positifs ont diminué au fil du temps Nos résultats initiaux étaient que% des patients chez qui les échantillons ont été reçus étaient positifs pour la PCR , alors qu’après des années, la proportion est tombée à% Nous suggérons les explications probables suivantes: dernières années dans le nombre de laboratoires privés qui offrent une PCR diagnostique pour HSV et les entérovirus les virus qui représentent le plus grand nombre de P positif Les résultats de la RC et l’éclosion d’infection par le VNO à New York en mai ont entraîné la présentation de spécimens associés à une gamme plus étendue de symptômes cliniques qu’auparavant. Des examens supplémentaires des cartes permettront éventuellement de clarifier les contributions de ces possibilités.

Remerciements

Nous remercions Myrna Sanders et Andrea Miller pour la saisie de données, Pamela Duncan pour son aide à la révision des dossiers et le Centre de génétique moléculaire du Centre Wadsworth pour fournir les oligonucléotides et pour le séquençage automatisé. Soutien financier en partie grâce au Programme des infections émergentes et aux centres de Accord de coopération en matière de contrôle et de prévention des maladies U / CCU-Conflit d’intérêts Tous les auteurs: Pas de conflit

Sylvie

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