Séquençage du génome entier pour la surveillance nationale d’Escherichia coli producteur de Shiga-toxine

Séquençage du génome entier pour la surveillance nationale d’Escherichia coli producteur de Shiga-toxine

Contexte La surveillance nationale des agents pathogènes gastro-intestinaux, tels que Escherichia coli O STEC O productrice de shigatoxines, est essentielle pour identifier rapidement les cas liés dans le réseau alimentaire distribué afin de faciliter les interventions de santé publique Dans cette étude, nous avons utilisé le séquençage du génome entier. Nous avons analysé rétrospectivement des isolats prélevés au hasard sur des souches de STEC O reçues par l’unité de référence des bactéries gastro-intestinales de Public Health England, Colindale, dans La distance génétique entre chaque isolat, tel qu’estimé par WGS, a été calculé et des méthodes phylogénétiques ont été utilisées pour placer les souches dans un contexte évolutifRésultats Estimations des clusters liés représentant les foyers de STEC O en Angleterre et au Pays de Galles augmentés par le WGS au lieu des techniques traditionnelles de typage Les clusters précédemment non identifiés étaient souvent larges L’analyse phylogénétique a facilité l’identification de cas temporellement distincts partageant des expositions communes et délimitant ceux qui partageaient des liens épidémiologiques et temporels Comparaison avec l’analyse de répétition en tandem à plusieurs variables MLVA a montré que bien que MLVA soit aussi sensible que WGS, WGS fournit un une résolution plus rapide des regroupements d’épidémies Conclusions Le WGS est devenu un outil de typage moléculaire pour informer la surveillance nationale des STEC O; il peut être utilisé en temps réel pour fournir la plus haute résolution au niveau des contraintes pour l’investigation des épidémies. Le WGS permet d’identifier les cas liés avec une spécificité et une sensibilité sans précédent qui faciliteront les enquêtes de santé publique ciblées et appropriées

Santé publique, séquençage du génome entier, Escherichia coli O productrice de Shiga toxine, surveillance nationale La maladie gastro-intestinale est un problème de santé publique important en Angleterre, avec jusqu’à% de la population subissant au moins un épisode de gastro-entérite aiguë chaque année. programme pour les maladies gastro-intestinales est impératif pour identifier les cas avec des expositions liées; Ceci est particulièrement pertinent pour les pathogènes qui peuvent entrer dans les réseaux alimentaires distribués au niveau national Bien que les enquêtes épidémiologiques conventionnelles utilisant des questionnaires détaillés et la recherche des contacts soient vitales, nous devons compléter ces activités par une méthode rapide et robuste de typage moléculaire pour différencier les cas liés. infections sporadiquesAvec & gt; Les isolats présomptifs soumis à l’unité de référence des bactéries gastro-intestinales GBRU annuellement , les infections à Escherichia coli O STEC O productrices de Shiga continuent d’exercer un fardeau de santé publique en Angleterre, économiquement et en termes de morbidité et de mortalité. De faible à sévère, mais généralement inclure la diarrhée sanglante Environ% des cas développent un syndrome hémolytique et urémique HUS Le principal réservoir de STEC O en Angleterre est le bétail, bien qu’il soit porté par d’autres animaux, principalement des ruminants. ou contact indirect avec des animaux ou leur environnement, consommation d’eau ou de nourriture contaminée, et contact de personne à personne La contamination de l’approvisionnement alimentaire peut provoquer des épidémies nationales et multinationales à grande échelle les ménages ou les institutions résidentielles, varient en nombre chaque année, mais depuis ont contribué entre% et% des isolats en Angleterre et Pays de Galles GBRU / Département des Infections Gastro-intestinales Emergentes et Zoonotiques, données internes, la majorité des cas étant apparemment sporadiques Tous les isolats reçus par GBRU sont systématiquement typés en phages , mais en Angleterre, la majorité des isolats sont soit PT ou PT /, et donc la capacité de cette méthode à discriminer entre les cas résultant d’expositions séparées est très faible Multi-nombre variable variable répétition tandem MLVA est utilisé pour fournir des niveaux plus élevés de discrimination des souches L’utilité du séquençage du génome entier WGS pour l’investigation des foyers a déjà démontré pour plusieurs agents pathogènes bactériens , et il y a de plus en plus de preuves dans la littérature pour la contribution positive du WGS aux épidémies impliquant des pathogènes gastro-intestinaux Le but de cette étude était d’élargir l’utilisation du WGS informer la surveillance nationale d’un agent pathogène majeur En validant l’approche WGS en utilisant une épidémie clairement définie et des cas sporadiques de ST EC O et en étudiant les résultats, WGS peut fournir des informations supplémentaires sur la définition de l’épidémie, les réseaux de transmission, et d’autres aspects de l’épidémiologie sous-jacente de ce pathogène

Méthodes

Sélection de souches

Un total d’isolats ont été sélectionnés pour le séquençage: des isolats ont été choisis au hasard parmi des isolats de culture STEC O positifs reçus par GBRU provenant de cas en Angleterre, au Pays de Galles et en Irlande du Nord au cours de; des isolats ont été choisis au hasard parmi des isolats positifs à la culture STEC O provenant de cas en Angleterre, au Pays de Galles et en Irlande du Nord et reçus par GBRU dans; et d’autres isolats historiques anglais reçus entre et ont été sélectionnés en fonction de la diversité du type de phage pour fournir un contexte en tant qu’échantillon de la population de référence. La collection totale contenait des souches de foyers connus, des grappes de ménages, des souches sérielles isolées du même patient et des souches cas sporadiques Un total de types de phages étaient représentés

Séquençage du génome et analyse de la séquence

L’ADN génomique a été fragmenté et étiqueté pour le multiplexage avec les kits de préparation d’échantillon d’ADN Illtera Illumina et séquencé en utilisant la plate-forme Illumina GAII avec des lectures de bp. Des lectures courtes ont été mappées à la souche de référence STEC O. La sortie de BWA a été triée et indexée pour produire une carte d’alignement binaire BAM en utilisant Samtools GATK a été utilisé pour créer un fichier de format d’appel variant de chacune des BAMs, qui ont été analysés pour extraire seulement les positions SNP de polymorphisme étaient de haute qualité dans tous les génomes Cartographie Qualité & gt ;, Profondeur & gt ;, Génotype Qualité & gt ;, Ratio Variant & gt; Un alignement des positions polymorphes a été utilisé pour créer des arbres de vraisemblance approximative en utilisant FastTree dans le modèle de Jukes-Cantor de l’évolution des nucléotides Les distances de SNP par paires entre les génomes de chaque souche ont été calculées dans le Centre National d’Information Biotechnologique Archive sous bioprojet PRJNA

Le traitement des données

Questionnaires de surveillance renforcés STEC Les SESQ sont administrés à tous les cas de STEC O en Angleterre Le SESQ recueille des données démographiques; statut de risque; état clinique, y compris la progression vers le SHU; les coordonnées du ménage ou d’autres personnes proches; les expositions, y compris les déplacements, la consommation d’aliments et d’eau, le contact avec les animaux et les facteurs environnementaux; classification épidémiologique des cas; Les données SESQ ont été examinées pour chaque souche sélectionnée et les souches classées en fonction du statut épidémiologique connu, du statut connu du groupe de ménage ou si plusieurs isolats provenaient du même patient. Toutes les souches remplissant ces critères ont été identifiées comme ayant un lien épidémiologique connu. Dans les épidémies signalées précédemment, l’apparition de la maladie dans les cas se produit une médiane de jours d’un autre cas lié avec un mode de santé publique. En utilisant des dates d’échantillons d’isolats, la temporalité entre les isolats de différentes distances génétiques a été calculée. comparé La distribution SNP par paire et les liens temporels entre les cas liés connus ont été examinés et un seuil de parenté déterminé en conséquence Les souches apparentées étant susceptibles de provenir d’une source commune, le seuil a été appelé seuil commun CST Ce seuil a ensuite été appliqué à toutes les autres souches dans l’ensemble de données et évalué pour l’épi contexte démiologiqueLes souches apparentées au sein du CST ont été classées en grappes sur la base d’une distance SNP au moins dans le CST vers un autre isolat dans le jeu de données Les grappes non identifiées précédemment ont été désignées grappes WGS liées Les liens temporels et géographiques entre les grappes ont été examinés et comparés Les relations phylogénétiques de Deeper ont également été étudiées afin de déterminer si elles fournissaient des informations ou des associations utiles sur le plan épidémiologique. Les clusters de distance génétique SNP ont été construits sous la forme de clusters phylogénétiques [PCs] et ceux avec & gt; CST cluster dans chaque PC ont été étudiés pour les associations épidémiologiques partagéesTous les isolats STEC O signalés entre mai et décembre qui ont été typés à la fois par MLVA et WGS ont été utilisés pour étudier la dynamique de regroupement pour chaque méthode L’analyse de survie a été utilisée pour tester l’hypothèse nulle Pour l’analyse de survie, un regroupement d’isolats avec un autre isolat basé sur ≤ locus variant pour MLVA ou ≤CST pour WGS a représenté un échec. Pendant toute la période d’étude, les isolats entreront à divers moments dans le temps. basé sur la date du rapport de laboratoire À ce moment, l’isolat risque de se regrouper avec d’autres isolats déjà dans la population étudiée ou des isolats entrant dans l’étude à une date ultérieure. Les estimations Kaplan-Meier de la fonction de survie ont été estimées pour les deux méthodes. courbes de survie avec tableaux d’accompagnement présentant les personnes à risque à un moment précis points L’hypothèse de risques proportionnels a été testée en traçant le risque cumulé de log dans les deux groupes. Lorsque l’hypothèse de risques proportionnels a été appliquée, la fonction de survie dans les groupes a été comparée en calculant un hazard ratio en utilisant la régression de Cox.

RÉSULTATS

Répartition de la distance par paires entre des isolats étroitement apparentés

Pour les souches utilisées dans cette étude, un lien épidémiologique avec au moins un autre cas était connu squelettique. Cela incluait les cas où plusieurs isolats ont été séquencés chez la même personne, des isolats faisant partie de groupes distincts de ménages et des cas de foyers connus. les souches n’avaient pas de lien commun précédemment identifié La distribution de distance SNP par paire a révélé qu’aucune paire d’isolats liés épidémiologiquement n’avait & gt; Différences de SNP avec une moyenne de SNP dans les isolats provenant du même écart-type de ménage [SD], ou SD commun connu, et SNP SD, d’isolats de la même personne

Figure Vue largeTéléchargement de diapositivesHistogramme montrant la proportion de paires contre le polymorphisme mononucléotidique SNP distance des cas avec un lien épidémiologique connuFigure Voir grandTélécharger diaposHistogramme montrant la proportion de paires contre le polymorphisme mononucléotidique SNP distance des cas avec un lien épidémiologique connuOne cent trente-six cas sans Les% de paires qui tombaient dans le seuil SNP comprenaient des souches isolées à quelques jours d’intervalle, avec un intervalle moyen entre des paires d’échantillons de jours Entre une distance génétique de et SNPs, l’intervalle moyen Comme tous les isolats précédemment liés se situaient à l’intérieur d’un seuil SNP et que la majorité des paires de cas dans ce seuil étaient liées temporellement, nous émettons l’hypothèse d’un seuil de SNP pour catégoriser les isolats comme apparentés. terme « apparenté » fait allusion à une source commune de l’infection et les souches qui sont dans les SNP d’un autre sont considérées comme relevant de la CST

Figure Vue largeDownload slideHistogramme montrant la fréquence des paires par rapport à la distance SNP du polymorphisme mononucléotidique Chaque barre est colorée en tant que proportion de paires isolées dans & lt; jours, – jours et & gt; daysFigure View largeTélécharger une diapositiveHistogramme montrant la fréquence des paires par rapport à la distance SNP du polymorphisme mononucléotidique Chaque barre est colorée en proportion des couples isolés dans & lt; jours, – jours et & gt; journées

Appliquer le CST

Cent soixante souches isolées au cours de la CST Ces souches peuvent être formées en grappes où les membres du cluster doivent partager au moins un lien au sein du CST Vingt des souches de clusters représentaient soit des foyers ou des souches multiples du même patient Les clusters restants comprenaient les souches représentant% de l’ensemble de données Enquête de santé publique de routine précédemment menée n’avait pas identifié de grappes, et elles étaient désignées grappes WGS liées des grappes liées WGS, comprises entre et cas, alors que les grappes plus importantes comprenaient et casaient Globalement, si nous concluons que tous les cas au sein du CST font partie de grappes épidémiologiquement liées, ceci correspond à une augmentation de la sensibilité de & g% dans la détection des cas liés en dehors du cadre du ménage lors de l’utilisation de WGS pour compléter l’approche actuelle

Épidémiologie des grappes liées à WGS

Figure A, avec une distance résidentielle moyenne de km SD, km pour le premier et km SD, km pour ce dernier Figure 2. La dispersion géographique des cas liés par le WGS reflète la distribution de l’épidémie nationale de PT ainsi que la répartition des cas. une épidémie géographiquement restreinte À l’inverse, les grappes épidémiologiquement liées reflétaient le plus étroitement l’éclosion géographiquement restreinte, soulignant la difficulté de reconnaître les cas distribués à l’échelle nationale sans discrimination de souche à haute résolution telle que la maladie

Figure Vue largeTélécharger la diapositiveA, diagramme Scatter montrant la distance résidentielle moyenne par paire de chaque groupe de contacts rapprochés par rapport à la taille en nombre de cas La coloration indique si le groupe a déjà été identifié par enquête épidémiologique ou si identifié par séquençage du génome entier. montrant la distribution de la distance résidentielle pour les grappes liées au WGS et les grappes épidémiologiquement reliées. PT National et PT / Farm représentent les épidémies distribuées d’origine alimentaire et ponctuelle, respectivement.Figure View largeTélécharger la diapositiveA, diagramme de Scatter montrant la distance résidentielle moyenne par paire de chaque grappe de contact proche de la taille en nombre de cas La coloration indique si la grappe a déjà été identifiée par une enquête épidémiologique ou si elle est identifiée par le séquençage du génome entier WGS seul B, Histogramme montrant la distribution de la distance résidentielle pour les grappes liées au WGS et les grappes épidémiologiquement liées PT Na Les épidémies de suivi épidémiologique rétrospectif ont été entreprises pour les cas dans les grappes WGS les plus importantes. Les grappes comprenaient des cas distribués à l’échelle nationale avec des dates de début toutes dans les jours les uns après les autres Après une nouvelle enquête, la seule exposition commune identifiée était la consommation d’une salade à feuilles préemballée spécifique provenant de différentes branches de la grande chaîne de supermarchés Cluster contenait des cas, dont des cas provenaient de régions de santé publique anglais distinctes avec des dates de début couvrant une semaine Après une nouvelle enquête, il a été identifié que des cas avaient visité le même village , où un autre cas était résident, dans la période d’incubation Tous les cas avaient été en randonnée dans le même parc national, les exposant au risque d’exposition environnementale Les cas restants ne partageaient aucune exposition évidente, suggérant que les cas étaient exposés à la même source d’infection. via différentes routes et / ou véhicules, h soulignant l’importance de l’utilisation de toutes les enquêtes épidémiologiques disponibles lors de l’interprétation du WGS pour les enquêtes sur les épidémies

La détection des flambées MLVA Versus WGS

Le regroupement basé sur le CST défini par WGS a augmenté la sensibilité dans l’identification des cas liés; Cependant, il était également nécessaire de comparer cette approche à d’autres méthodes de typage fine déployées pour STEC. Exemple: MLVA Utilisant une analyse de survie des échantillons typés par les deux méthodes en -, la survie, c’est-à-dire non en cluster avec un autre isolat, n’a montré aucune différence significative avec MLVA vs WGS CST basé sur le regroupement d’un seul isolat avec un autre test de log-rank pour l’égalité de la fonction de survivant: P =; Cox hazard ratio =, P = Figure Ceci indique qu’il n’y a pas de différence de rapidité de clustering entre les méthodes Cependant, lorsque nous considérons le temps de clusterisation, tous les cas d’un cluster sont regroupés à partir de l’événement de cluster initial. , il y a une augmentation significative de la vitesse dans l’achèvement des grappes avec WGS CST par rapport au test du log-rank MLVA pour l’égalité de la fonction de survivant: P =; Cox hazard ratio =, P = Figure

Figure Vue largeTéléchargement de diapositivesKaplan-Meier Estimations des échecs et des risques proportionnels test d’hypothèse montrant qu’il n’y a pas de différence de temps de clustering entre le séquençage du génome entier WGS et multi-nombre de variables variables tandem répétition MLVAFigure View largeTéléchargement slideKaplan-Meier estimations d’échec et test d’hypothèse de risques proportionnels montrant qu’il n’y a pas de différence dans la rapidité de la mise en grappes entre le séquençage du génome entier WGS et l’analyse répétée en tandem à plusieurs variables MLVA

Figure View largeTélécharger le slideKaplan-Meier Estimations de survie et test d’hypothèse des risques proportionnels montrant qu’après la mise en grappes des isolats, le séquençage du génome entier est significativement plus rapide avec le séquençage du génome entier qu’avec l’analyse répétée en tandem MLVAFigure View largeTélécharger slideKaplan-Meier Estimation de survie et test d’hypothèse de risques proportionnels montrant qu’après la mise en grappes des isolats, le délai d’achèvement de cette grappe est significativement plus rapide avec le séquençage du génome entier qu’avec l’analyse répétée en tandem à plusieurs variables MLVA

Contexte épidémiologique des amas phylogénétiques

Bien que la relation temporelle entre les paires se soit rapidement dissipée à mesure que la distance génétique se déplaçait en dehors du CST, nous avons étudié si des relations phylogénétiques plus profondes fournissaient également des informations épidémiologiquement utiles. associations Dix-neuf PC voient la section «Méthodes» ont été identifiés et n’avaient aucune association géographique ou exposition commune entre les grappes CST au sein du SESQ One PC contenait des clusters CST partageant une exposition commune à un parc national dans le Midlands Figure; chaque grappe a été corrélée avec l’année d’isolement, mettant en évidence le potentiel d’identifier la persistance des souches dans l’environnement au fil du temps

Figure Vue largeDiscrétion maximale phylogénie des isolats représentant des polymorphismes mononucléotidiques SNP de la séquence d’ADN codante SNP non codants avec une taille totale du génome de base de bp associée à des cas ayant visité le même parc national Les clusters représentent différents groupes de seuils de source communs, colorés en rouge, bleu et vert dans un seul groupe phylogénétique Le niveau de résolution permet la délinéation des souches d’années différentes La souche en rouge était temporellement liée aux souches en bleu mais significativement différente génomiquement pour suggérer une source différente d’exposition à Escherichia coli productrice de shigatineFigure View largeDownload slideMaximité probable phylogénie des isolats représentant des polymorphismes mononucléotidiques SNP à travers des SNP non codants de séquence d’ADN codant avec une taille totale du génome de base de bp associée à des cas ayant visité le même parc national Les clusters représentent différents clusters de seuils de source commune, col rouge, bleu et vert dans un seul groupe phylogénétique Le niveau de résolution permet la délimitation de souches d’années différentes. La souche en rouge était temporellement liée aux souches en bleu mais significativement différente génomiquement pour suggérer une source différente de production de toxine Shiga. Exposition à Escherichia coli Deux PC contenaient des clusters CST où la majorité des souches étaient d’origine nord-irlandaise. Les patients qui ne résidaient pas en Irlande du Nord ont déclaré voyager dans diverses régions de la province dans leur SESQ. la figure du Moyen-Orient

Figure Vue largeDiscrétion maximale phylogénie des isolats, représentant des SNP de polymorphismes mononucléotidiques, à travers les SNP non codants de la séquence d’ADN codante avec une taille totale du génome principal de bp Les grappes de seuil de source commune identifiées par le séquençage du génome entier Les WGS seuls sont rouges et ceux identifiés par Les clusters phylogénétiques qui contenaient des souches avec des expositions connexes sont ombrés greenFigure View largeTélécharger la diapositiveProfil maximal de phylogénie des isolats, représentant des SNP de polymorphismes mononucléotidiques, à travers des SNP codant des séquences d’ADN non codantes avec une taille totale du génome de bp. à travers le séquençage du génome entier Les WGS seules sont colorées en rouge, et celles identifiées par des méthodes traditionnelles sont colorées en bleu Les groupements phylogénétiques qui contenaient des souches avec des expositions associées sont en vert ombré

DISCUSSION

Dans cette étude, le potentiel de WGS dans la surveillance nationale du STEC O a été évalué pour sa capacité à améliorer la détection des épidémies et à fournir des informations supplémentaires sur les enquêtes épidémiologiques conventionnelles WGS a confirmé que les souches du même patient, des cas au sein du même ménage et des cas Ces cas tombaient dans un seuil de SNP dans lequel nous avons trouvé de fortes corrélations temporelles suggérant un lien épidémiologique. En utilisant cette limite observée empiriquement des SNPs, nous avons pu déterminer avec une clarté sans précédent quelles souches de STEC O WGS a détecté des cas liés de STEC O dans des souches représentatives d’une saison annuelle avec deux fois la sensibilité des méthodes actuelles. Ceci suggère que la détection d’une épidémie actuelle est hautement spécifique, mais relativement insensible, et que l’estimation précédente des foyers, impliquant ≥ cas dans une maison différente Les grappes précédemment isolées étaient souvent plus dispersées géographiquement que celles identifiées en utilisant l’approche traditionnelle. Il est suggéré que ces foyers géographiquement dispersés sans exposition commune évidente sont d’origine alimentaire. Dans cette étude, nous montrons que pour identifier les cas liés, le seuil actuel de ≤ locus variant pour le clustering fournit la même sensibilité que l’utilisation du WGS CST. une conclusion importante, car elle donne non seulement confiance dans l’interprétation de MLVA aux laboratoires de santé publique pas encore prêts à adopter les méthodologies WGS, mais permet également la communication croisée des résultats entre les praticiens de ces techniques Une distinction importante entre les méthodes est le temps prend pour résoudre des grappes complètes de cas dans une épidémie, WGS CST complétant des grappes significativement plus rapidement que MLVA Cette caractéristique peut s’expliquer par le fait que tous les cas liés tendent à tomber dans le CST pour tous les cas, alors que dans un grand cluster MLVA plusieurs isolats via un isolat intermédiaire, c.-à-d. des variantes de double locus réunies par un variant de locus unique partagé Ce phénomène a des implications dans la définition précise de la définition de cas microbiologique au début d’une enquête épidémiologique. Le contexte phylogénétique des grappes de sources communes a été analysé pour voir s’il existait un signal épidémiologique entre des événements communs distincts mais connexes Plusieurs PC régionaux ou liés au voyage ont été identifiés, soulignant l’isolement géographique de STEC O même dans les îles britanniques Le signal géographique observé dans le WGS de STEC O a été Par exemple, les isolats pourraient être liés à des aliments provenant de régions spécifiques du monde, ou des cas pourraient être exclus d’une éclosion ponctuelle en confirmant que leur souche est originaire de plus Les principaux objectifs de la surveillance des maladies gastro-intestinales sont d’identifier les épidémies, surveiller les tendances à long terme et informer l’efficacité des politiques et autres interventions de santé publique. WGS démontre une sensibilité et une précision inégalées dans l’identification des cas liés couplés à la classification phylogénétique Les contraintes sont liées au temps et à l’espace Sa capacité à définir avec précision les cas sporadiques permet de mieux caractériser la population à risque et d’évaluer l’importance relative des expositions conduisant à des infections sporadiques pouvant différer de celles menant à des épidémies. dat En outre, la possibilité d’exclure sans ambiguïté les associations empêchera la prise de mesures de santé publique inappropriées, ce qui économisera des ressources pour la protection de la santé. et niveau des autorités locales Une bonne communication et un partage rapide des données STEC O WGS en temps réel avec des collègues travaillant dans l’agriculture, la médecine vétérinaire et l’agroalimentaire à travers les frontières internationales permettraient de remonter à leurs sources et de révéler des facteurs de risque spécifiques dans la chaîne alimentaire et l’environnement, facilitant ainsi le ciblage des ressources et des interventions de santé publique pour avoir un impact maximal sur la réduction du fardeau de la maladie STEC O en Angleterre

Remarques

Remerciements Nous tenons à remercier tout le personnel de l’unité de référence des bactéries gastro-intestinales et des infections gastro-intestinales émergentes et zoonotiques qui travaillent sur STEC ODisclaimer Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’Institut national des sciences médicales générales ou le National Institutes of Health NIHF soutien financier Ce travail a été soutenu par le numéro de subvention du fonds de développement de recherche scientifique de l’Institut national de recherche en santé WPH a été soutenu par l’Institut national des sciences médicales générales du numéro de prix NIH UGMP conflits d’intérêts potentiels Discuter de Discuva Ltd et a reçu un financement de Hoffmann-La Roche WPH a reçu des fonds d’Antigen Discovery Ltd Tous les autres auteurs ne signalent aucun conflit potentielTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels Conflits d’intérêts que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu de le manuscrit a été divulgué

Sylvie

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